對F44、DeltardrA和FrdrA菌株進行酸耐受性試驗。由圖2D可知,在pH為3.0的酸應激下,F44菌株的存活率為22.37%±3.09%,DeltardrA菌株的存活率為47.89%±5.18%,FrdrA菌株的存活率為26.22%±2.60%。與F44菌株相比,FrdrA菌株的酸耐受能力無顯著變化;而DeltardrA菌株的酸耐受能力是F44菌株的2.14倍,二者差異極顯著(P<0.01),說明轉錄因子RdrA對F44菌株酸耐受能力起抑制作用。
測定F44和DeltardrA菌株在發酵6、8、10、12h時的Nisin效價，結果如圖2E所示。可以看出，F44和DeltardrA菌株的Nisin產量均在8h達到峰值,F44菌株的Nisin效價為(1990.08±45.46)IU/mL,DeltardrA菌株的Nisin效價為(2073.66±65.57)IU/mL。DeltardrA菌株與對照菌株相比，Nisin產量略有提升，但二者差異不顯著。
綜上結果分析，轉錄因子RdrA對菌株生長情況和Nisin產量影響不顯著，但對F44菌株的酸耐受及Nisin耐受能力有抑制作用。
2.3轉錄組學分析
為了進一步研究轉錄因子RdrA對于菌株中基因轉錄的影響，以DeltardrA菌株為試驗組，F44為對照組,利用IlluminaNovaSeq6000測序平臺進行轉錄組測序。對樣本進行相關性分析，以保證試驗樣本合理、數據可靠。試驗采用皮爾遜相關系數表示樣品間基因的表達水平相關性，相關系數在0.8~1.0之間屬于極強相關，越接近于1表明樣品之間表達模式越接近。如圖3所示，兩組平行樣本間的相關性高，樣本可以進行后續轉錄組學測序分析。對測序結果進行篩選，將log2foldchange
1且P值<0.05的基因定義為差異表達基因(DEGs)。
由表4可見,DEGs共12個,其中6個基因的轉錄量顯著上調，6個基因的轉錄量顯著下調。通過eggNOG的功能分類分析(圖4),發現差異顯著基因集中在“P.無機鹽轉運和代謝”“F.核酸轉運和代謝”“G.碳水化合物轉運和代謝”“T.信號轉導機制”“E.氨基酸轉運和代謝”“J.翻譯、核糖體結構與合成”及“L.基因重組、復制與修復”幾大類中。其中，J、L類基因影響蛋白質修飾和DNA分子的保護與修復，對細菌抵御酸脅迫至關重要。KEGG富集分析表明(圖5),DEGs集中在ABC轉運蛋白、嘧啶代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝以及磷酸轉移酶系統相關代謝途徑中，其中氨基酸等物質轉運和代謝與eggNOG功能分類分析結果一致，但沒有與菌株酸耐受直接相關的代謝通路。
表4菌株△rdrA中轉錄水平變化顯著基因
圖4菌株△rdrA中轉錄差異顯著基因的eggNOG功能分類結果
注：J.翻譯、核糖體結構與合成；A.RNA加工修飾；K.轉錄；L.基因重組、復制和修復；B.染色質結構和動力學；D.細胞周期控制、細胞分裂和染色體分裂；Y.核結構；V.抵御機制；T.信號轉導機制；M.細胞壁/膜/被膜的生物合成；N.細胞活性；Z.細胞骨架；W.胞外結構；U.胞內運輸、分泌和囊泡運輸；O.翻譯后修飾、蛋白質折疊和伴侶蛋白；C.能量生成和轉換；G.碳水化合物轉運和代謝；E.氨基酸轉運和代謝；F.核酸轉運和代謝；H.輔酶轉運代謝；I.脂肪轉運和代謝；P.無機鹽轉運和代謝；Q.次級代謝物合成、轉運和代謝；R.主要功能預測；S.未知功能。
圖5菌株△rdrA差異表達基因KEGGPathway富集分析
2.4實時熒光定量PCR驗證結果
為驗證轉錄組測序結果，對顯著差異基因進行實時熒光定量PCR，與轉錄組測序結果進行比較，試驗結果如圖6所示。其中，D-蛋氨酸轉運結合蛋白編碼基因plpA、plpB、plpC的相對表達量分別為1.20±0.14、1.46±0.22、1.39±0.20；O-乙酰高絲氨酸巰基酶編碼基因cysD表達量為1.38±0.35；重組DNA修復蛋白編碼基因DYH_g1322表達量為1.63±0.25；蛋白N端乙酰基轉移酶編碼基因yhjG表達量為1.54±0.17。結合圖5可以看出，上述基因表達量的變化趨勢與轉錄組數據一致，證明轉錄組數據可以作為研究轉錄因子RdrA調控機制的依據。
圖6實時熒光定量PCR結果