2結果與分析
2.1 Sprodbtg基因的擴增
本實驗室前期構建的質粒pET28a-prodbtg中目的基因未發生突變，以該質粒作為模板，分別用引物P1、R1和P2、R1擴增基因Sprodbtg.PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得約為1,100,bp的目的片段（圖1），其大小與Sprodbtg預計大小相符，表明Sprodbtg擴增成功。該基因上游外源加入了一段SD序列及C.glutamicum高效分泌蛋白的信號肽序列ΔS0949，使得prodbtg具有了在C.glutamicum中分泌表達的潛力。
2.2重組質粒pXMJ19-Sprodbtg的構建
將PCR產物切膠回收后用限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切，后與同樣經過HindⅢ和BamHⅠ雙酶切的質粒pXMJ19連接，然后轉化至E.coli JM109，涂布含氯霉素質量濃度為50,μg/mL的平板。經篩選挑取陽性菌落活化后提取質粒，用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切驗證，同時將pXMJ19空質粒用HindⅢ進行單酶切作為對照，結果如圖2所示。空質粒經HindⅢ單酶切獲得約6,600,bp的片段，重組質粒經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切獲得約6,600,bp和1,100,bp的兩條帶，其中大片段與空質粒pXMJ19大小（6,600,bp）相符，小片段與目的基因Sprodbtg大小相符，表明Sprodbtg基因已成功連接到表達載體上。
2.3谷氨酸棒桿菌的電轉化及鑒定
提取重組質粒pXMJ19-Sprodbtg并電擊轉化谷氨酸棒桿菌感受態細胞，以空質粒pXMJ19作為對照菌株。涂布于含氯霉素10,μg/mL的LA抗性平板，挑取轉化子酶切驗證。
2.4重組菌的誘導表達
按照1.2.4方法對轉化子進行誘導表達，將誘導48,h后的重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg和對照菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19發酵液經TCA沉淀濃縮后進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示。
圖3重組谷氨酸棒桿菌發酵上清液SDS-PAGE分析
泳道1陽性轉化子C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg在大約3.8×104處出現1條特異性蛋白條帶，其大小與預測的proD-BTG的相對分子質量一致。泳道2中對照菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19未見相應目的蛋白條帶，從而初步說明proD-BTG在谷氨酸棒桿菌中被成功分泌表達。
2.5酶原蛋白proD-BTG的酶活力測定
重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表達酶原蛋白proD-BTG經Factor Xa切割后，熒光法測定酶活力，結果顯示BTG活力為（41.23±2.01）U/L。
2.6重組菌C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導條件優化
2.6.1生長曲線的繪制
重組菌在氯霉素濃度為10μg/mL的MMTG培養基中的生長曲線如圖4所示。由圖4可知：重組菌株4,h后進入對數生長期，14,h后生長減緩，18 h后進入穩定期。
2.6.2誘導時機對目的蛋白proD-BTG表達的影響
取不同誘導時機的發酵液添加Factor Xa并測定重組菌BTG的活力，結果如圖5所示。在培養4 h后進行誘導，目的蛋白在重組菌中表達量非常低；然后隨著菌體密度的增大而進行誘導，目的蛋白的表達量也隨之增加。在培養12 h（A600約為2.2）時進行誘導達到最高酶活力（47.43±2.34）U/L，此時為重組菌對數生長期的中后期，目的蛋白的表達量基本達到最大，之后表達量開始下降，這可能是后期培養基中的營養被大量消耗，缺乏充足的營養用于目的蛋白的合成，因此當培養12,h后開始誘導，為最適的誘導時機。
圖4 C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg生長曲線
圖5不同誘導時機對proD-BTG蛋白表達的影響
2.6.3誘導時間對目的蛋白proD-BTG表達的影響
如圖6所示，當誘導時間為10——40 h時，目的蛋白的表達量隨著誘導時間的增加而增加，最高達到（54.69±3.35）U/L；而當誘導時間超過40 h后，表達量有所下降，推測可能由于菌體開始進入衰亡期，裂解的菌體釋放出的蛋白酶降解了部分重組蛋白，導致重組蛋白表達量的下降。所以最佳誘導時間定為40 h.
圖6不同誘導時間對proD-BTG蛋白表達的影響
2.6.4 IPTG濃度對目標蛋白proD-BTG表達的影響
IPTG對細胞有一定的毒性，所以加入合適濃度的IPTG，才能使目的蛋白得到高效表達。IPTG濃度在0.01——5.0,mmol/L的范圍內可能對表達產生影響。IPTG濃度對目標蛋白proD-BTG表達的影響如圖7所示。
圖7不同IPTG濃度對proD-BTG蛋白表達的影響
當IPTG濃度為0.4——0.8 mmol/L時，目的蛋白的表達量隨著IPTG濃度的增加而增加，最高達到（55.62±2.34）U/L；當IPTG濃度增大到1.0 mmol/L時，目的蛋白的表達量也能達到最高，但考慮到成本的節約，將0.8 mmol/L作為IPTG的最優誘導濃度。
3結語
本文在前期研究的基礎上，對谷氨酸棒桿菌重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg的發酵條件進行優化。重組菌培養12 h后A600約為2.2時，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，誘導40 h.優化后的發酵上清液酶活力由（41.23±2.01）U/L提高到（55.62±2.34）U/L，比優化前提高了約34.90%,，為BTG進一步的高效制備奠定了基礎。
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