1.3.3高滲脅迫處理無菌條件下，用打孔器(直徑為7 mm)在01-23和STM-35菌落外緣打取菌盤，然后接種至3種不同山梨醇濃度(1.0，1.5，2.0 mol/L)的DPA培養基平板上，置于恒溫培養箱中25℃黑暗培養，以在無山梨醇的DPA培養基上生長的菌株為對照(CK)。
1.3.4菌落、菌絲形態觀察及生長速率測定將菌株在高滲固體培養基上培養8 d后，觀察菌落形態，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率，顯微觀察菌絲的形態特征及發育情況。
抑制率=(對照菌落直徑-高滲處理菌落直徑)/(對照菌落直徑)×100%。
1.3.5脂類物質沉積的形態學觀察將2.0 mol/L山梨醇處理的WT和KO菌株利用油紅O染液進行脂肪染色、制片，并在顯微鏡下觀察脂類物質沉積的形態學變化。染色參照陳侃等[17]的方法略作修改，具體步驟：取培養10 d的菌株，向培養皿中加入3 mL無菌水，輕輕刮取菌絲，用雙層擦鏡紙過濾，濾液經12 000 r/min離心5 min后去掉上清，收集沉淀，用液氮反復凍融5次，轉入4%中性甲醛中固定12 h，取出用PBS漂洗后放入60%異丙醇中浸泡30 min，取出后加入50μL油紅O染液，黑暗條件下染色24 h，置于60%異丙醇中脫色，顯微鏡下觀察染色情況并照相。
1.4數據統計分析
利用IBM SPSS Statistics(version 19)軟件(SPSS Inc.)對試驗數據進行ANOVA方差分析。
2結果與分析
2.1玉米大斑病菌高滲脅迫培養基的篩選
由于PDA培養基中馬鈴薯浸提液中含有鹽離子，并且不同馬鈴薯品種及熬煮時間都可能對其浸提液中鹽離子濃度產生影響，從而干擾本試驗中高滲脅迫分析結果。而蛋白胨作為一種化學產品，不僅排除了生產工藝的干擾，而且蛋白胨中不含鹽離子或鹽離子非常少，不會影響本試驗中高滲脅迫分析結果，因此本研究采用蛋白胨代替馬鈴薯浸提液的DPA培養基進行高滲脅迫分析。通過比較WT菌株與KO菌株在PDA和DPA培養基上的菌絲形態，結果發現，在PDA培養基上WT菌株與KO菌株生長菌絲形態有較明顯的區別，WT菌株的菌絲細胞內有明顯顆粒狀內容物出現，而KO菌株的菌絲細胞內無明顯顆粒狀內容物。在DPA培養基上，WT菌株與KO菌株的菌絲細胞內均有明顯的顆粒狀物出現，2種菌株的菌絲狀態相似。因此，DPA培養基更適于分析STK1基因對滲透脅迫的調控作用。
2.2山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落生長的影響
山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落生長速度的影響見圖1。
由圖1可以看出，在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株與WT菌株的菌落生長速度沒有顯著差異，但在1.5和2.0 mol/L山梨醇脅迫條件下，KO菌株的菌落生長速度都顯著低于WT菌株，表明KO菌株對較高濃度山梨醇的滲透脅迫比WT菌株更敏感。
對WT菌株，未加山梨醇和山梨醇濃度為1.0 mol/L的DPA培養基中，WT菌株的菌落生長速度基本上一致；當山梨醇濃度大于1.0 mol/L時，濃度越大，菌落生長速度越慢(圖1-A)，即高濃度山梨醇對WT菌株菌落生長速度有顯著抑制作用。
對KO菌株，在1.0 mol/L山梨醇高滲脅迫條件下，KO菌株的生長速度顯著加快，當山梨醇濃度增加到1.5和2.0 mol/L時，菌落生長速度又顯著減慢，說明一定濃度山梨醇高滲脅迫對KO菌株的菌落生長速度有促進作用，但高濃度山梨醇卻有抑制作用(圖1-A)。
由圖1-B可以看出，除在1.0 mol/L山梨醇脅迫條件下KO菌株的菌落生長速度得到顯著的促進作用以外，其它處理的菌落生長速度均受到顯著的抑制作用。在1.5和2.0 mol/L山梨醇滲透脅迫下，KO菌株菌落生長速度的抑制率顯著高于WT菌株。
2.3山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落形態和顏色的影響
在山梨醇高滲脅迫條件下，WT菌株和KO菌株的菌落形態沒有顯著變化，但菌落顏色變化非常明顯。在山梨醇高滲脅迫條件下，WT菌株的菌落顏色由黑色變為灰白色，而KO菌株則在1.5 mol/L山梨醇脅迫條件下菌落顏色變深，在1.0和2.0 mol/L山梨醇脅迫條件下菌落顏色變淺(圖2)。
圖2山梨醇高滲脅迫對玉米大斑病菌菌落形態和顏色的影響
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