A型塞內卡病毒（Senecavirus A，SVA）屬于RNA病毒科（Picornaviridae）塞內卡病毒屬（Senecavirus）成員，目前僅有一個型，與心病毒屬（Cardioviruses）成員親緣關系較近。SVA感染可引起豬口鼻部及冠狀帶出現水泡樣病變，同時可伴隨跛行、厭食、嗜睡、皮膚充血、發熱等癥狀，與口蹄疫（FMD）、豬水泡病（SVD）、水泡性口炎（VS）等疫病難以區分。SVA為單股正鏈RNA病毒，其基因組全長約7.3 kb，包含由666個核苷酸組成的5'端非編碼區（UTR）。非編碼區后是1個單一的長開放閱讀框，編碼2 181個氨基酸組成的多聚蛋白，可被切割成12個多肽，包括先導蛋白（L）、4個結構蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7個非結構蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。SVA 3'端非編碼區有71個核苷酸，后面連有poly（A）尾巴。
反向遺傳技術已經廣泛應用于各類RNA病毒研究。該技術可實現在分子水平上對病毒定向改造，為RNA病毒基因功能及致病機理研究、新型疫苗研制等提供了有效方法。RNA病毒的主要反向遺傳學方法是，基于質粒系統遞送病毒全長cDNA，細胞內cDNA能在RNA聚合酶啟動子的作用下被轉錄成為病毒RNA，這些RNA隨后被翻譯成多肽并被加工為成熟的病毒結構與非結構蛋白，與病毒RNA一起包裝成具有感染性的病毒粒子。據報道，已有的SVA反向遺傳平臺構建主要基于酶切連接方法，這種方法是通過RT-PCR在體外擴增病毒基因片段，利用限制性內切酶，特異性地將片段逐個構建到質粒載體上，這種方法需要進行酶切、連接、單克隆鑒定、測序等復雜程序，出錯率高，耗時較長。
本研究擬利用同源重組法一次性將SVA全基因組片段、CMV啟動子、poly（A）尾巴及丁肝核酶序列（HDVr）等元件整合進低拷貝載體pWSK-29中，構建SVA全長感染性克隆（pWSK-29-SVA），并拯救出與親本毒株生物學功能一致的重組病毒（rSVA），以期縮短反向遺傳平臺構建時間，為進一步研究SVA致病機理、研制新型疫苗奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1病毒、細胞、載體SVA-GXT91毒株，由本實驗室分離、保存；BHK-21細胞、pWSK-29質粒、EGFP N2質粒，為本實驗室保存。
1.1.2主要試劑
病毒RNA/DNA核酸自動提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；反轉錄酶、高保真DNA聚合酶、同源重組酶、DH5α感受態細胞，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Qiagen公司；質粒抽提試劑盒，購自天根生化科技有限公司；全自動微生物生長曲線分析儀，購自Bioscreen公司；DMEM培養基、Lipofectamine 3000，購自Invitrogen公司；胎牛血清，購自金源康生物工程有限公司。
1.2方法
1.2.1引物設計構建方案如下：以EGFP N2質粒為模板，設計含有同源臂的CMV啟動子引物，以SVA-GXT91 RNA為模板設計含同源臂SVA基因全長引物（表1）。含同源臂的poly（A）尾巴+HDVr，由引物自結合擴增形成。
表1構建SVA感染性克隆的引物序列
1.2.2感染性克隆構建
以pWSK-29為載體，采用同源重組技術構建pWSK-29-SVA感染性克隆。以SVA-GXT91 RNA為模板，擴增SVA病毒基因片段；以引物為模板，自結合擴增poly（A）+HDVr；以EGFP N2質粒為模板，擴增CMV啟動子。將pWSK-29載體酶切線性化，與SVA全基因組、CMV啟動子及poly（A）+HDVr按比例混合，在同源重組酶ExnaseMulitS催化下，37℃反應30 min即可完成同源重組結合，實現體外環化。100μL感受態細胞置于冰上融化后，加入10μL構建好的SVA感染性克隆質粒，輕搖混勻，冰上靜置30 min；隨即在42℃水浴中熱激90 s，迅速置于冰上2 min，然后置于800μL無抗生素的LB培養液中37℃搖床震蕩（180 r/min）45 min；以4 000 r/min離心5 min，棄去部分上清，將剩余100μL液體吹吸混勻，涂布在氨芐抗性LB培養板上；將培養板倒置在37℃恒溫箱中培養過夜，并于次日菌落長出后進行菌落PCR鑒定。
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