1.5堿性磷酸酶(AKP)活性測定
測定不同濃度沒食子酸溶液在不同時間對溶藻弧菌細胞壁的影響。取對數生長期的溶藻弧菌5 000 r/min離心5 min，用PBS重懸配制成1×10?CFU/mL的菌懸液。實驗組為在10 mL 1×10?CFU/mL溶藻弧菌菌液中分別加入10 mL不同濃度的沒食子酸溶液，使藥物終濃度分別為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS為陽性對照組。每組設3個平行。溶藻弧菌在28℃、180 r/min搖床振蕩培養，分別在0、2、4、6、8 h時各組的每個平行取樣1 mL，在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液備用，使用AKP試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)測定上清液在520 nm波長下的吸光值，并按說明書計算各組AKP活性。
1.6電導率測定
測定不同濃度沒食子酸在2 h時對溶藻弧菌細胞膜的影響。各組處理方法參照1.5。溶藻弧菌在28℃、180 r/min搖床振蕩培養2 h，各組分別取樣9 mL，在4℃、6 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，用酶標儀在450 nm波長下測定菌體培養液的電導率。
1.7生物被膜的形成
采用結晶紫染色法測定不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌生物被膜形成的影響。菌液配制方法參照1.3。分別取100μL不同濃度的沒食子酸溶液加入到96孔板中，并加入等量的1×10?CFU/mL菌液，使沒食子酸溶液的終濃度分別為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。以菌液加等量的PBS為陽性對照組。每組設3個平行。溶藻弧菌在28℃靜置培養24 h后，將孔中液體吸出，并用無菌PBS沖洗去除浮游細菌，添加200μL甲醇固定15 min，加入200μL 0.5%的結晶紫溶液，室溫靜置20 min，吸出結晶紫溶液，無菌蒸餾水沖洗并風干。加入200μL 33%的醋酸溶液溶解，靜置15 min后，用酶標儀測定595 nm條件下的吸光值，以33%醋酸溶液為空白對照。
1.8生物被膜的清除
采用結晶紫染色法測定不同濃度沒食子酸溶液對成熟生物被膜清除的影響。菌液配制方法如1.3。在96孔板各孔中分別加入200μL 1×10?CFU/mL菌液。28℃靜置培養24 h后，將孔中液體吸出，并用無菌PBS輕柔沖洗2次，晾干后得到成熟生物被膜。在形成生物被膜的各孔中，分別各添加200μL 2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC的沒食子酸溶液作為實驗組，添加200μL PBS作為對照組。每組設3個平行。28℃靜置培養24 h后將孔中液體吸出，并用無菌PBS沖洗2次，200μL甲醇固定15 min，加入200μL 0.5%的結晶紫溶液，室溫靜置20 min，吸出結晶紫溶液，無菌蒸餾水沖洗并風干。用200μL 33%醋酸溶液溶解，15 min后用酶標儀測定595 nm處的吸光值，以33%醋酸溶液為空白對照。
1.9泳動能力測定
測定不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌泳動能力的影響。按1.3中的方法配制菌液。配制含濃度為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC沒食子酸的0.3%瓊脂LB半固體平板。含等量PBS的0.3%瓊脂LB半固體平板作為對照組。取2μL 1×10?CFU/mL的菌液接種于平板中心，28℃靜置培養24 h后，采用十字交叉法測定細菌運動直徑大小。
1.10聚集能力測定
測定不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌的聚集能力的影響。按1.3中的方法配制菌液。實驗組為取10 mL 1×10?CFU/mL溶藻弧菌菌液，分別加入等量不同濃度的沒食子酸溶液，使藥物終濃度為2MIC、1MIC、1/2MIC、1/4MIC。陽性對照組為在菌液中加入等量PBS。每組設3個平行。28℃培養24 h。待培養結束，在靜止狀態下，各管分別吸取3 mL菌液測定其在600 nm處的吸光度，再將各管剩余菌液振蕩懸浮，測定其在600 nm處的吸光度。計算公式為：
2結果
2.1沒食子酸對溶藻弧菌的抑菌作用
采用二倍稀釋法和平板計數法測定沒食子酸對溶藻弧菌的抑菌效果。實驗結果顯示，沒食子酸對溶藻弧菌的MIC和MBC分別為4 mg/mL和8 mg/mL。
不同濃度的沒食子酸對溶藻弧菌生長的影響效果見圖1。2MIC和1MIC的沒食子酸能完全抑制溶藻弧菌生長，OD值顯著低于不加藥物的陽性對照組。1/2MIC的沒食子酸能顯著抑制溶藻弧菌生長，菌株在8 h左右達到平臺期，平臺期菌液濃度明顯低于陽性對照組。1/4MIC的沒食子酸對溶藻弧菌生長無明顯影響。綜上所示，1/2MIC以上濃度的沒食子酸對溶藻弧菌生長有良好的抑制作用，且抑制效果隨濃度增加逐漸增強。
2.2沒食子酸對溶藻弧菌細胞壁完整性的影響
細胞壁是細菌維持形態、保護菌體的重要結構。AKP位于細胞壁和細胞膜之間，在細胞壁未受損時，胞外無法檢測到AKP，當細胞壁被破壞受損時，AKP從細胞中漏出，AKP可以作為評價細胞壁通透性的指標。不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌細胞壁的影響見圖2。結果顯示，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC處理組的細菌培養液中AKP含量前2 h迅速上升，之后呈逐漸穩定上升的趨勢。結果表明，1、2、4、8 mg/mL濃度的沒食子酸在2 h內均能破壞溶藻弧菌細胞壁或增加細胞壁的通透性，導致AKP滲出。沒食子酸溶液濃度越高、作用時間越長，對溶藻弧菌細胞壁的破壞程度越大。與處理組相比，陽性對照組的AKP含量始終處于較低水平，且無明顯變化。其在4~8 h的含量上升，推測可能是細菌正常生命活動過程中的裂解死亡所致。
2.3沒食子酸對溶藻弧菌電導率的影響
細胞膜是細菌強有力的保護屏障，而細胞膜的導電性是細胞膜通透性的重要指標，當細菌細胞膜完整性被破壞，滲透性增加，細胞中的Na?、K?泄漏，導致上清液的電導率變大。不同濃度的沒食子酸對溶藻弧菌電導率影響結果見圖3。結果顯示，1/2MIC、1MIC和2MIC處理組的細菌培養液在2 h時，OD450mm顯著高于對照組(P<0.05)；1/4MIC處理組的細菌培養液在2 h時，OD450mm與對照組無顯著差異(P＞0.05)。1/2MIC以上濃度的沒食子酸可顯著增強溶藻弧菌細胞膜的通透性，且其作用強度隨沒食子酸濃度增加而增強。
注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
2.4沒食子酸對溶藻弧菌生物被膜形成的影響
生物膜是細菌重要的生存策略，具有抵抗外界環境壓力、提供營養支持、促進表面粘附和傳導信號等作用。不同濃度沒食子酸對溶藻弧菌生物被膜形成的影響如圖4所示。與陽性對照組相比，1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC濃度沒食子酸對溶藻弧菌生物被膜的形成均有顯著抑制作用(P<0.05)，抑制率分別為16.61%、32.37%、77.80%和83.26%。結果表明，沒食子酸能有效抑制溶藻弧菌生物被膜的形成，抑制作用隨其濃度的增加而增強。
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