摘要：【目的】構建牛種布魯氏菌(B.abortus)A19株效應蛋白BspE基因缺失株，探究其生長特性及在宿主細胞中的生存、黏附及入侵能力，并觀察BspE蛋白的亞細胞定位情況。【方法】以牛種布魯氏菌A19為研究對象，運用同源重組及SacB反向篩選技術構建布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株A19ΔBspE，并通過質粒回補方法構建其回補株A19CΔBspE，比較3種菌株在體外的生長特性；通過平板計數方法分析BspE基因缺失對布魯氏菌在細胞內的生存及黏附和入侵細胞能力的影響；通過間接免疫熒光試驗檢測BspE蛋白在RAW264.7細胞中的定位情況。【結果】菌液PCR結果顯示，獲得大小為2 060 bp的特異性條帶，成功構建BspE基因缺失株A19ΔBspE；Western blotting結果顯示，獲得大小約為14.59 ku的BspE-flag條帶，成功構建回補株A19CΔBspE。生長曲線結果顯示，在相同的培養條件下，A19ΔBspE與牛種布魯氏菌A19、A19CΔBspE的生長趨勢沒有顯著差異(P＞0.05)，均在8 h達對數生長期，32 h進入平臺期。胞內增殖試驗結果顯示，在感染48 h內，A19ΔBspE在RAW264.7細胞中的生存能力與牛種布魯氏菌A19、A19CΔBspE無顯著差異(P＞0.05)。細菌黏附和入侵試驗結果顯示，A19ΔBspE黏附和入侵RAW264.7細胞的能力與牛種布魯氏菌A19、A19CΔBspE沒有顯著差異(P＞0.05)。間接免疫熒光試驗結果顯示，BspE蛋白主要分布于核周區域。【結論】本研究證實了BspE基因的缺失不影響布魯氏菌在體外的生長及在RAW264.7細胞中的生存、黏附及入侵能力，且BspE蛋白主要定位在核周區域，為后續研究布魯氏菌效應蛋白BspE的生物學功能和致病機制奠定基礎。
布魯氏菌病(brucellosis)是一種由布魯氏菌引起的人獸共患病，對人類健康及畜牧業的經濟發展構成了極大的威脅。目前，布魯氏菌病的防控主要依靠減毒活疫苗，雖然起到了重要的防控作用，但也存在一些問題，如干擾診斷、殘存毒力及孕畜流產等。許多胞內寄生菌通過分泌效應蛋白來促進它們在宿主細胞中的生存和增殖。布魯氏菌通過分泌多種毒力因子逃避機體的免疫應答，在機體內生存和增殖。IV型分泌系統(type IV secretion system，T4SS)是布魯氏菌重要的毒力因子，其所分泌的效應蛋白對布魯氏菌在細胞中的生存和感染后的免疫反應具有調控作用。目前已發現17個與T4SS相關的效應蛋白，分別為VceA、VceC、RicA、BPE005、BPE043、BPE123、BPE275、BtpA、BtpB、SepA、BspA、BspB、BspC、BspE、BspF、BspJ及BspL，它們在布魯氏菌感染宿主的過程中發揮著重要作用。在這些效應蛋白中，BspE蛋白的功能尚不清楚，從目前的研究分析來看，BspE包含螺旋線圈和跨膜結構域，主要參與形成離散的囊泡，但其在布魯氏菌感染宿主細胞過程中的作用尚不清楚。為探究效應蛋白BspE的功能和作用，本研究構建牛種布魯氏菌A19效應蛋白BspE基因缺失株和回補株，研究其對布魯氏菌體外生長變化及在RAW264.7細胞中生存、黏附和入侵能力的影響，為進一步探究BspE的生物學功能及致病機理奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1主要試劑
牛種布魯氏菌A19疫苗株、PUC19-SacB、pET-28a(+)和pBBR1MCS質粒及小鼠巨噬細胞RAW264.7保存于中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物細菌病團隊重點實驗室;Donkey Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®)及Donkey Anti-Mouse IgG H&L(Alexa Fluor®647)二抗購自Abcam公司;Primer STAR Max Premix購自百奧基生物科技有限公司;ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit、DNA Marker均購自蘭州賽維斯生物科技有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自蘭州博瑞生物科技有限公司;蛋白質分子質量標準、一抗稀釋液、ECL Super Kit均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;Anti-DDDDK Tag Antibody購自上海生基生物科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG購自甘肅偉博鑫生物科技有限公司。
1.1.2主要儀器
恒溫培養箱、電熱恒溫水槽均購自上海一恒科學儀器有限公司;電泳儀購自北京六一生物科技有限公司;微生物生長曲線分析儀，Bioscreen公司；PCR儀、垂直電泳系統、凝膠成像系統、電穿孔儀均購自Bio-Rad公司;離心機購自Eppendorf公司;生物安全柜購自蘇州安泰公司。
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