嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila隸屬弧菌科、氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于淡水、污水、土壤及人體糞便中。魚感染該菌后鰓部、體表出血潰爛，內臟發白，可引起急性胃炎、腸炎等病癥，是一種典型“人-獸-魚”共患病原菌。近年來由嗜水氣單胞菌引發水生動物的病例不斷增多，是水生動物尤其是魚類最常見的致病菌。該菌嚴重威脅水產養殖業的發展和人類健康。研究表明，選擇具有代表性的免疫原性好的嗜水氣單胞菌菌株，制備滅活疫苗，用于魚類浸泡或注射免疫，在魚類嗜水氣單胞菌病防控上取得了良好效果。在規模化生產菌體過程中，細菌的數量和致病力受溫度、鹽度、pH、碳源、氮源等培養條件的影響。本試驗通過研究不同培養條件下嗜水氣單胞菌的生長，優化工業化生產嗜水氣單胞菌的培養條件，以期為嗜水氣單胞菌工業化生產該菌滅活疫苗及防控魚類嗜水氣單胞菌病提供基礎資料。
1材料與方法
1.1材料
嗜水氣單胞菌GZ1株由貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室保存。
胰蛋白胨、酵母粉與瓊脂糖均購自上海博微生物科技有限公司；NaCl購自重慶川江化學試劑公司；HCl（分析純度38%）和NaOH（分析純度32%），均購自杭州聯科生物有限公司；可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂等均購自上成都市科龍化工試劑廠。
1.2方法
1.2.1菌種培養方法
將菌株劃線接種在以胰蛋白胨為氮源、酵母粉為碳源的LB固體培養基上，37℃恒溫培養24h，挑取單個菌落，接種LB液體培養基，30℃搖床振蕩培養24h，8000r/min，離心5min，取菌體，用無菌PBS洗滌3次，取沉淀，配制成濃度為1×108cfu/mL菌懸液，4℃保藏備用。
1.2.2不同培養條件對嗜水氣單胞菌GZ1株生長狀況的影響
取培養24h菌液，8000r/min離心5min，取菌體，無菌PBS洗滌3次，取菌懸液0.5mL，加PBS至5mL，倍比稀釋，用平板計數法測定菌液細菌含量，以無菌PBS為對照，以菌液細菌含量為Y軸，菌液OD600為X軸，構建回歸方程。
生長曲線的測定：將上述菌液接種于LB液體培養基，30℃搖床振蕩（180r/min）培養，用分光光度計測定培養第2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、18℃、24℃、36℃、48h菌液OD600，用回歸方程公式計算細菌濃度，以培養時間為橫坐標，細菌濃度為縱坐標，繪制嗜水氣單胞菌生長曲線。
溫度：培養溫度分別設為4℃、25℃、28℃、30℃和37℃，方法同1.2.2，24h時以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較溫度對GZ1株生長的影響。
pH：用NaOH和HCl調節培養基pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，每個處理設3個重復，24h時以無菌LB液體培養基為對照，比較pH對GZ1株的影響。
NaCl濃度：分別調制0%、1%、2%、3%、4%和5%NaCl的LB液體培養基，加入1%對數期GZ1株菌液，30℃、180 r/min振蕩培養24h，以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較NaCl濃度對GZ1株生長的影響。
Mg2+濃度：添加硫酸鎂，調制Mg2+濃度分別為1mg/L、2.5mg/L、5mg/L和10 mg/L的LB培養基，培養24h時以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較Mg2+濃度對GZ1株生長的影響。
碳源：用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、碳酸鈉配制成碳濃度為0.42 g/L的不同碳源培養基，培養24h時以無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較碳源對GZ1株生長的影響。
氮源：用氯化銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母粉配制成氮濃度為0.71g/L的不同氮源培養基，加入1%對數期GZ1株菌液30℃、180 r/min振蕩培養24h，無菌LB液體培養基為對照，每個處理設3個重復，比較氮源對GZ1株生長的影響。
1.2.3正交試驗設計
在單因素對嗜水氣單胞菌GZ1株生長影響的基礎上，取溫度、pH、NaCl濃度、Mg2+濃度4個因素作為考察因素，每個因素設3個水平，以細菌濃度為指標，設計正交試驗表1。
表1正交試驗設計表
1.2.4數據處理
結果以平均數和標準偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0軟件進行分析。
2結果與分析
2.1嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程與生長曲線
細菌含量與OD600成線性關系（圖1），其回歸方程為：Y=17.65X+0.43，Y為細菌含量（×108cfu·mL-1），X為OD600。
圖1嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程
由圖2可知，在30℃時，前12h為該菌生長延遲期，12～24h為生長對數期，24～36h為生長穩定期，36 h后進入衰亡期。
圖2嗜水氣單胞菌GZ1株生長曲線
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