摘要:提升菌株酸耐受能力在工業生產中有重要經濟價值。研究發現，乳酸乳球菌F44中一種功能未知的DeoR/GlpR家族轉錄因子RdrA與菌株酸耐受能力相關。為研究RdrA對F44菌株耐酸性能的影響，比較rdrA缺陷型、過表達菌株和F44原始菌株的生長曲線、pH曲線、酸耐受、Nisin耐受和Nisin效價,對RdrA的功能進行表征。此外,對rdrA缺陷突變型菌株和F44原始菌株進行轉錄組學測序,進一步研究RdrA影響F44菌株酸耐受的靶標基因和代謝通路。轉錄組測序和qPCR結果表明，RdrA主要通過抑制細胞被膜的流動性和韌性,降低胞內蛋氨酸水平,以及抑制DNA分子修復和蛋白修飾過程,降低F44酸耐受能力。研究首次揭示未知功能的轉錄因子RdrA,為提高乳酸乳球菌耐酸性能提供了新的研究方向和分子靶點，在工業生產中具有重要意義。
乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是一種革蘭氏陽性菌，被美國食品和藥物管理局(FDA)認定為一般公認安全(GRAs)的微生物，廣泛應用于功能性食品工業。
乳酸鏈球菌素(Nisin)是乳酸乳球菌發酵產生的一種羊毛硫氨酸細菌素，具有主要針對革蘭氏陽性菌的抑菌活性，目前已經廣泛應用于食品保鮮行業。Nisin的抑菌機制主要有兩種:其一，Nisin通過與細胞壁肽聚糖合成過程中的必需中間體一脂質體II結合，抑制細菌細胞壁合成，使細菌細胞變形死亡;其二，Nisin作用于細胞膜形成孔道，破壞細胞跨膜電位和pH梯度，造成胞內物質流失，使細胞裂解死亡。Nisin生產菌株對Nisin具有特定的保護機制，主要通過ABC轉運蛋白(NisFEG)將胞內Nisin排出體外,并通過膜結合脂蛋白(NisI)于胞外結合Nisin形成不溶性復合物，避免細胞膜被Nisin攻擊。
由于乳酸乳球菌代謝產酸的特性，酸脅迫是乳酸菌生長過程中面臨的主要環境壓力。乳酸菌生長的最適環境pH為5.5~6.0，然而隨著發酵過程的進行，乳酸逐漸積累使胞內外pH下降，影響胞內多種酶活性，破壞細胞被膜結構，引起細胞死亡。目前，乳酸菌進化出多種耐酸機制，如生物被膜修飾、三磷酸腺苷依賴型質子泵系統、氨基酸脫氨與脫羧系統以及大分子保護與修復等響應酸應激。除此之外，轉錄因子也能通過影響酸應激相關基因的表達，調節細胞代謝活動，適應環境變化。如乳酸乳球菌F44中PspC家族轉錄因子YthA參與精氨酸脫亞胺酶(ADI)途徑并促進精氨酸生物合成，幫助菌株抵御酸應激并提高Nisin產量。雙組份系統轉錄因子TcsR7上調DLT操縱子轉錄水平，降低細胞膜內外電勢差，提高乳酸乳球菌F44耐酸能力。在乳酸乳球菌CECT8666中，胍胍丁胺通過胍胍丁胺脫亞胺酶水解催化產生腐胺和銨鹽來抵抗酸脅迫,同時介導轉錄因子AguR結合aguB啟動子，激活aguBDAC操縱子的轉錄以提高菌株酸耐受能力。
乳酸乳球菌轉錄因子RdrA屬于DeoR/GlpR家族，該家族主要調控碳水化合物代謝或核苷酸代謝過程,多數情況下通過形成阻遏蛋白抑制相關代謝途徑的糖磷酸效應分子，起抑制性轉錄因子的作用。在大腸桿菌中，DeoR和GlpR分別調節脫氧核糖核酸代謝途徑和sn-甘油三磷酸代謝途徑的基因表達。近年研究發現，DeoR/GlpR家族轉錄因子也與環境耐受相關。在單核細胞增生李斯特氏菌中，DeoR家族轉錄因子FruR是一種果糖操縱子轉錄抑制蛋白，可以通過誘導磷酸戊糖途徑基因表達和抑制糖酵解基因表達來調控單核細胞增生李斯特氏菌的碳代謝，同時產生還原型輔酶II保護菌株響應氧化應激。豬鏈球菌中GlpR抑制甘油代謝酶基因表達，在抑制甘油利用效率的同時提升豬鏈球菌抵御氧化應激能力，并且提升菌株在巨噬細胞中的存活率和細胞毒力。耐金屬貪銅菌中敲除glpR基因使菌株對高濃度鋅脅迫抗性增強。
乳酸乳球菌F44中DeoR/GlpR家族轉錄因子RdrA的具體功能目前尚未研究。本試驗旨在探究轉錄因子RdrA對乳酸乳球菌酸耐受和Nisin產量的影響，并通過轉錄組學測序技術尋找RdrA下游調控靶標，探索其基因功能，解析RdrA調控機制，為進一步工程改造乳酸乳球菌奠定基礎。
1材料與方法
1.1材料與設備
1.1.1菌株與試劑
菌株:乳酸乳球菌F44,實驗室保藏菌種;敲除rdrA基因的F44菌株,本試驗構建菌株,記作DeltardrA;過表達rdrA基因的F44菌株,本試驗構建菌株,記作FrdrA。
蔗糖、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、十二水合磷酸氫二鈉，上海麥克林生化科技股份有限公司;蛋白胨胨、氯化鈉、D-無水葡萄糖、七水合硫酸鎂、半胱氨酸、瓊脂粉、NisinZ標準品,北京索萊寶科技有限公司;酵母粉、胰蛋白胨胨，英國Oxoid公司;玉米漿，北京奧博星生物技術有限公司;細菌總RNA提取試劑盒DP430，天根生化科技(北京)有限公司;2xSYBRGreenqPCRMix試劑盒,山東思科捷生物技術有限公司。
1.1.2培養基
改良LB培養基:胰蛋白胨胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L,D-無水葡萄糖5g/L,調節pH至7.0。
乳酸乳球菌種子培養基:蔗糖15g/L,蛋白胨胨15g/L,酵母粉15g/L,磷酸二氫鉀20g/L,氯化鈉1.5g/L,七水合硫酸鎂0.15g/L,調節pH至7.0。
發酵培養基:在種子培養基的基礎上加入3g/L玉米漿和2.6g/L半胱氨酸。
效價培養基:D-無水葡萄糖5g/L,胰蛋白胨胨8g/L,酵母粉2.5g/L,十二水合磷酸氫二鈉5g/L,氯化鈉5g/L,調節pH至7.2。
以上固體培養基另行加入15g/L瓊脂粉。
1.1.3儀器設備
HFsafe-1200LC生物安全柜,香港力康生物醫療科技公司;5200Multi發光成像系統，上海天能生命科學有限公司;UV-1800PC紫外分光光度計,翱藝儀器(上海)有限公司;GL-1908高低溫振蕩金屬浴,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;LightCycler480II實時熒光定量PCR儀，羅氏診斷產品(上海)有限公司。
1.2方法
1.2.1菌株構建
1.2.1.1rdrA過表達菌株構建
使用p124-rdrA-F/R引物擴增F44基因組中rdrA基因,以pLEB124質粒為載體,使用BamHI和HindIII酶切位點連接至載體上。將重組質粒化學轉化至大腸桿菌TG1中，提取質粒，將測序正確的重組質粒電轉化進入乳酸乳球菌F44中，使用pLEB124-YZ-F/R引物進行菌落PCR并進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。設計引物如表1所示。
表1rdrA過表達菌株構建引物序列