根據GenBanK中發表的多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，P.multocida）HN06株（登錄號為NC017027）的ompH核苷酸序列設計合成一對特異性引物，將PCR擴增獲得的牦牛源P.multocida C47-8的ompH基因片段連接到pMR10載體上，構建了C47-8株ΔompH缺失株互補質粒pMR10-ΔompH，并將該質粒電轉化至C47-8ΔompH缺失株中，成功獲得其互補菌株。在此基礎上，對C47-8親本株、ΔompH缺失株以及互補株的生物學特性進行研究。形態學觀察結果表明，3株菌的生長形態無差異；生化試驗結果表明，除了缺失株發酵蕈糖、硝酸鹽試驗呈現陽性外，3株菌的其余生化特性未發生改變；體外生長曲線表明親本株C47-8的生長速度比缺失株和互補株的生長速度慢，說明ompH基因對C47-8的生長有顯著影響。本試驗為深入研究P.multocida的致病機制以及研制安全有效的基因缺失減毒活疫苗奠定了基礎。
體外生長曲線的測定3個菌株的OD600值，繪制細菌體外生長曲線，每個菌株做3個重復，用SPSS19.0軟件進行分析，并根據生長曲線測定出細菌的代時。
體外生長曲線的測定將P.multocida菌液每隔1 h測定3次OD600值，將得到的數據用SPSS19.0軟件進行統計學分析，并繪制體外生長曲線，結果見圖。
C47-8親本株、缺失株和互補株體外生長曲線的測定結果
從圖可知，親本株生長速度較慢，而缺失株和互補株則生長速度較快，由此可以確定ompH基因明顯影響了C47-8的生長。
2.3.4根據生長曲線測定出細菌的代時（G）C47-8親本株代時為1.248 h，缺失株為0.727 h，互補株為0.765 h。表明C47-8親本株代時最長，互補株居中，缺失株最快，說明ompH基因的缺失影響了P.multocida的生長。
討論
目前，青海省預防牦牛出血性敗血癥主要使用的是20世紀80年代從黃牛體中分離獲得的C45-2全菌滅活苗，但免疫效果差。隨著各種病原體反向遺傳操作技術體系的建立，越來越多的人將注意力轉移到了篩選與疾病流行相符合的地方血清型靶向缺失株，期望通過缺失關鍵的毒力相關基因，使毒力減弱，但保持免疫原性從而達到控制疾病的目的。
本研究前期選擇ompH基因作為缺失目標，選用具有陽性Amp抗性基因和蔗糖陰性篩選基因sacB的pEX18AP質粒為缺失載體，成功構建了
3株無抗性基因標記的P.multocida的ompH基因缺失株，構建過程中沒有插入新的基因，避免了外源基因對缺失菌株的干擾和潛在的生物安全危險，為基因缺失疫苗的研究提供了可能。
本研究在對牦牛源P.multocida C47-8株外膜蛋白H基因的缺失株和互補株的形態學特性觀察研究中發現3個菌株菌落形態沒有發生改變，說明ompH不參與菌落形態的維持。生化試驗發現C47-8缺失株發酵蕈糖，硝酸鹽試驗呈陽性，與親本株和互補株不同，其原因可能是ompH蛋白對P.multocida起著負調控作用。該菌分解蕈糖可以為細菌在宿主細胞中的存活提供相應的碳源和氮源，而ompH基因的缺失使P.multocida的轉錄不再受到抑制，為細菌供應充足的碳源和氮源，以便細菌的大量繁殖。體外生長曲線表明缺失株和互補株的生長速度比親本株快，并且缺失株和互補株的菌體繁殖活力比親本株強，說明ompH基因對C47-8的生長有明顯影響，但是該基因具體通過什么方式和途徑影響菌體生長？其原因有待于進一步研究。
ompH蛋白作為交叉保護的一種良好的候選抗原受到研究者們越來越多的關注。本試驗構建出的牦牛源P.multocida C47-8ΔompH互補株生物學特性試驗發現，ompH基因的缺失導致產生了新的生物學表型，為下一步研制P.multocida基因缺失疫苗提供了重要的理論依據。
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