深海（水深超過1000米）生物圈是地球上最大的生態系統之一，孕育著多種生命形式。估計那里存在超過1029個微生物細胞。此外，每天伴隨著海雪、鯨落和洋流，大量微生物從表層海水被動遷移到深海水中。這些微生物的遷移伴隨著壓力的增加和溫度的降低。深海具有高壓、低溫、黑暗等極端環境特性，曾被認為是生命的禁區，但近些年發現深海生存著大量的微生物資源，形成了獨特的深海生態系統。高靜水壓力（HHP）對微生物細胞的許多生理活動有很大的抑制作用，例如膜流動性、RNA合成、運動性、營養吸收、細胞分裂、蛋白質合成和復制。生活在深海的微生物類群必須能夠耐受深海高靜水壓。到目前為止，雖然已經揭示了深海微生物適應高壓環境的一些策略，例如增加細胞膜的流動性，調整細胞代謝途徑等，但是至今沒有發現和鑒定出深海微生物耐壓相關的功能基因和代謝機制。
三甲胺(TMA)和三甲胺N-氧化物(TMAO)是廣泛分布在海洋中的含氮有機化合物。描述了TMAO在海洋微生物中的兩個功能。TMAO被α-變形菌的SAR11進化枝和海洋玫瑰桿菌進化枝用作氮源。Myroides profundi D25 T是擬桿菌門的成員，從沖繩海槽南部的深海沉積物（水深1245米）中分離出來。研究發現菌株D25是一種耐壓細菌，它使用TMAO作為壓電電解質來應對HHP應激。菌株D25通過TMA轉運蛋白TmaT吸收TMA，然后使用TMA單加氧酶(Mp Tmm)將TMA氧化成TMAO。由此產生的細胞內TMAO的積累能夠在高壓下生長。本研究揭示了TMA/TMAO在海洋細菌中的新功能，并提供了獨特的代謝途徑與深海細菌中HHP適應之間的直接聯系。
芬蘭Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
使用含有3%(m/v)人造海鹽、維生素復合物、1 mM TMA或TMAO、10 mM葡萄糖、0.2 mM Na3PO4、10 mM Hepes和5μM FeCl3(36)的確定培養基測試菌株D25和DSS-3是否可以使用TMA或TMAO作為氮源。使用自動生長曲線分析儀（Bioscreen）記錄在25°C培養的兩種菌株的生長情況。
實驗結果：TMAO是一種蛋白質穩定劑，可以抵消HHP對海洋動物的影響。研究發現菌株D25是一種耐壓細菌，它使用TMAO作為壓電電解質來應對HHP應激。菌株D25通過TMA轉運蛋白TmaT吸收TMA，然后使用TMA單加氧酶(Mp Tmm)將TMA氧化成TMAO。由此產生的細胞內TMAO的積累能夠在高壓下生長。TMA的存在還改善了擬桿菌門中其他細菌的生長，這些細菌在HHP下含有編碼TmaT和Mp Tmm同源物的基因，表明這可能是深海擬桿菌門采用的常見策略。揭示了TMA/TMAO在海洋細菌中的新功能，并提供了獨特的代謝途徑與深海細菌中HHP適應之間的直接聯系。
圖1、(A)以TMA或TMAO為唯一氮源培養的菌株D25和DSS-3的生長曲線。(B)D25菌株在初始TMA濃度為85μM的2216E培養基中培養的TMA和胞內TMA和TMAO濃度的變化。(C)應變D25菌株在4°C下在0.1、20和40 MPa下添加或不添加10μM TMA的生長曲線。(D)10μM TMAO或TMA對菌株D25在不同壓力下生長和存活的影響。孵育開始（開始）時的細胞數約為1×10 6CFU/毫升。將培養物在4°C下培養10天，然后計算CFU并與起始培養物的CFU進行比較。紅線是指培養物中細胞的完全死亡對照。在沒有TMAO或TMA的情況下培養的菌株D25。(E)D25菌株在不同壓力下添加或不添加10μM TMA的形態學觀察。
圖2、(A)重組Mp Tmm在4°和25°C下氧化TMA的非線性擬合曲線。(B)不同濃度TMA對D25菌株Mptmm基因表達的影響。菌株D25在有或沒有TMA的2216E培養基中培養1小時。(C)靜水壓力對D25菌株Mptmm基因表達的影響。菌株D25在2216E培養基中在大氣壓、20或40 MPa下培養1小時。(D)Mp Tmm和Rn Tmm的結構比較。Mp Tmm為黃色，Rn Tmm為紫色。(E)Mp Tmm和Rn Tmm晶體結構中NADP+(左)和FAD(右)位置的比較。FAD和NADP+分子顯示為Mp Tmm為黃色和Rn Tmm為紫色的棒。(F)溫度對Mp Tmm活性的影響。(G)DSC測量Mp Tmm的T m值。(H)分別在25°和4°C測量不同壓力下的酶活性。
圖3、TmaT的表征。(A)實時定量PCR檢測靜水壓力對菌株D25基因tmaT表達的影響。菌株D25在2216E培養基中在大氣壓、20或40 MPa下培養1小時。誤差條代表來自三次實驗的SD。（B到E）將TMA或TMAO滴定為TmaT的ITC曲線。顯示了ITC跡線（頂部）和綜合結合等溫線（底部）。滴定底物和溫度如圖所示。(F)TmaT及其與其他BCCT轉運蛋白的同源物的分子系統發育分析。序列來自IMG/JGI數據庫。BetP、BetT和CaiT分別是甘氨酸甜菜堿、膽堿和肉堿的BCCT轉運蛋白。
圖4、TMA等季胺對菌株D25在高溫高壓下生長的影響。a）不同濃度的TMA對菌株D25在20 MPa下生長的影響。培養基由3%人工海鹽、0.05%蛋白胨、0.01%酵母粉和不同濃度的TMA組成。培養物在25℃下培養2天。b）不同壓力下季胺對菌株D25生長的影響。培養基中添加3%人工海鹽、0.05%蛋白胨、0.01%酵母粉和20μM季胺。培養物在25℃下培養2天?？刂疲缓景?。誤差條表示三次重復實驗的標準差。
圖5、TmaT和Mp Tmm在重組大腸桿菌DH5α、大腸桿菌突變體Δtor CAD和枯草芽孢桿菌168中的體內功能。(A,C,和D)TmaT和Mp Tmm的表達對大腸桿菌DH5α(A)、Δtor CAD(C)和B.subtilis 168(D)在不同壓力下48小時培養的生長和存活的影響。孵育開始（開始）時的細胞數約為1×105 CFU/毫升。將菌株在25°C下培養48小時，加入或不加入20μM TMA，然后計數CFU并與起始培養物（結束/開始）進行比較。(B)Δtor CAD共表達TmaT和Mp Tmm的細胞在25°C不同壓力下加或不加20μM TMA培養48小時的形態學觀察。
總結：本研究以深海細菌Myroides profundi D25為研究對象，發現該菌株能夠利用三甲胺（TMA）轉運載體TmaT吸收深海環境中的TMA，在細菌胞內誘導表達三甲胺單加氧酶MpTmm，將TMA氧化為氧化三甲胺（TMAO），并在胞內累積。在深海高壓下，TMAO能夠保護蛋白質等生物大分子，使其維持正常的構象，發揮生物學功能，從而使得D25菌株具有耐受深海高靜水壓的能力，維持生存和生長。將TmaT-MpTmm蛋白在大腸桿菌和枯草桿菌菌株中表達，可顯著提高大腸桿菌和枯草桿菌菌株的耐壓能力。生物信息學分析表明TmaT和MpTmm同源蛋白在海洋細菌，尤其是擬桿菌門細菌中廣泛分布，表明這可能是深海細菌普遍采用一種耐壓策略，具有重要理論意義。