土壤微生物能分解和合成有機物，參與全球元素循環，它們能夠以互利共生的方式活躍于植物根表，形成結構復雜的根際微生物群落，影響植物營養吸收和健康［1］。這些聚集于根際的微生物群落形成了植物“第二基因組”［2-3］。根際微生物與植物的關系類似于腸道微生物與人體的關系［4］。植物能通過根際分泌物以及免疫系統物質調節根際微生物群落的構成，而根際微生物也能通過代謝活動參與到植物的生長發育、養分吸收和脅迫響應等過程［1］。盡管越來越多的根際微生物被研究，揭示出有促生與生防功能，但根際微生物與植物建立的作用關系是否長久穩定，仍不清楚。
隨著人們對過度施用化肥引起的生態環境問題的重視，農業綠色持續發展的關注，包括尿素、二胺等氮肥過剩引起的土壤元素不平衡、植物徒長、果實品質低和水體污染、富營養化，甚至誘發大氣中氮氧化物等溫室氣體含量增加等問題［5］。在農業生產中，替代如氮肥等化肥，減輕其引起的環境問題，已經刻不容緩。微生物研究者關注到根際微生物的潛在價值，憑借微生物的固氮作用，探究施用菌劑替代氮肥的可行性。雷海英等［6］采用阿須貝氏（Ashby）無氮培養基，從苦參的根際土中篩選到2株根際固氮菌，分別隸屬于芽孢桿菌屬和假單孢菌屬，將菌劑添加到苦參幼苗中，生長30 d后顯示出添加菌劑增加了植株的株高和葉片數，促進了植物幼苗生長。薛智權等［7］采用Ashby無氮培養基篩選到2株具有固氮能力的細菌，黃芪種子分別經2種菌液浸泡后種植，與未浸泡菌液的對照相比，株高分別增加了17.8%和64.4%，葉片數也顯著增加。程杰杰等［8］研究分離自玉米根際的固氮菌株對玉米和水稻的促生效果，結果顯示，施用菌液對玉米和水稻的生長具有促進作用。然而，篩選的根際促生細菌是否能夠穩定地促進植物生長，或者頻繁地施加促生菌菌劑是否會對植物產生負效應，卻鮮有報道。
番茄（Lycopersicon esculentum）屬于管狀花目茄科番茄屬，是世界上價值較高的水果和蔬菜［9］。我國是世界上最大的番茄生產和消費國家之一，2021年我國番茄產量達6 609萬t，在蔬菜作物中位居榜首［10-11］。我國番茄種植方式已從露天種植逐步轉向大棚設施內，提質、增效和集約化管理、生物防治、減肥減藥的原則逐漸深入人心［10］。探究施用根際細菌對番茄生長的影響，具有推動番茄健康發展的重要意義。筆者采用Ashby無氮培養基從番茄根際土中篩選根際固氮菌，研究根際細菌對番茄幼苗根系及生長的影響，揭示根際細菌在番茄栽培中的應用潛力與風險。
1材料與方法
1.1試驗材料
菌株篩選于番茄根際土壤，該土壤樣品為2022年3月采集于山西農業大學東陽試驗基地大棚內結果期番茄植株根際。
盆栽試驗供試番茄品種為晉番茄四號；栽培基質采用蛭石；栽培花盆的規格為直徑12.0 cm×高12.5 cm×底徑10.0 cm。
1.2培養基
LB液體培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121℃高壓蒸汽滅菌21 min備用。
LB固體培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂16.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121℃高壓蒸汽滅菌21 min備用。
阿須貝氏（Ashby）無氮培養基：甘露醇10.0 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂15.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 6.8～7.0。
1.3菌株篩選與鑒定
稱量采集的番茄根際土1 g，將土樣置于含有玻璃珠的錐形瓶中，添加99 mL無菌水，然后37℃、170 r/min振蕩30 min，獲得土壤懸濁液。取懸濁液1 mL，使用梯度稀釋法，稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的懸濁液。然后每一濃度吸取200μL涂布到Ashby無氮培養基平板上。上述過程重復３次。37℃恒溫培養48 h，觀察菌落的大小、顏色、邊緣、光澤、透明度等。使用接種環挑取不同形態的菌落，分別在新的Ashby無氮培養基平板上反復純化，挑取單菌落反復純化至少7次。將純化的菌株接種到LB固體培養基斜面和Ashby無氮培養基斜面上，置于4℃冰箱保存以供下一步使用。另添加20%甘油若滴，保存于-80℃冰箱內。該過程最終篩選獲得5株菌株，分別命名為F1、FN1、FN2、FN3、FN6。
菌株鑒定采用16S rDNA的分子鑒定方法。收集1 mL OD600為1.0～1.5的細菌菌液，離心棄上清后加入含有酶RNase A的緩沖液，加入溶菌酶，室溫靜置5 min，反復離心、沖洗與水浴，提取細菌的基因組DNA。采用引物27F和1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）進行PCR擴增。反應體系為基因組DNA 1.0μL，10×Buffer（含Mg2+）5.0μL，Taq聚合酶1.0μL，dNTP 1.0μL，正反引物各1.5μL，補充ddH2O至50.0μL。程序為95℃預變性5 min，然后95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，進行35個循環，最終72℃延伸7 min。按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進行PCR產物的回收。使用ABI3730-XL測序儀進行DNA測序，將測序結果與NCBI核酸數據庫進行比對，獲得物質序列相似性最大的物種信息，作為鑒定結果。
1.4菌液的制備
使用接種環分別挑取在LB固體培養基平板上活化的5株菌株的單菌落，接種至250 mL LB液體培養基中，重復3次。30℃170 r/min恒溫振蕩培養3 d，獲得菌液。將重復培養獲得的菌液混合搖勻，用于盆栽試驗。
1.5盆栽試驗
自2023年2月12日至3月28日，在山西農業大學玻璃溫室內進行盆栽試驗，以自然光為光照條件，溫度維持在15～35℃，濕度維持在40%～65%。采用完全隨機設計，以番茄作為供試植物，分別添加篩選到的菌株F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌液作為處理，添加未接種菌株的培養液作為對照CK，設置6個重復，每盆保留2株植株，共36盆。
挑選外形大小一致且飽滿的番茄種子，用75%乙醇溶液浸泡5 min進行消毒，然后使用蒸餾水沖洗3次，再將種子浸泡在含有無菌水的培養皿內。栽培基質選取蛭石，先采用高壓蒸汽滅菌法121℃、90 min進行滅菌，然后晾干。花盆使用75%乙醇進行消毒。在每個花盆中裝入滅菌的蛭石500 g，然后將番茄種子點播到蛭石表面2 cm以下，每盤點播3粒。采用稱重法保持含水量為80%。10 d出苗后，保留長勢一致的植株，每盆間苗為2株，每盆澆灌Hogland營養液20 mL。繼續種植14 d后，進行施用菌劑處理。分別添加F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌株制成的菌液和未接種菌株的培養液100 mL，24和34 d后，都再次施用相應的菌液100 mL。44 d后，測量番茄植株的株高、莖粗和SPAD值，然后收獲植株。
1.6指標測量
株高的測量使用精度為1 mm的直尺；莖粗的測量使用精度為0.01 mm的游標卡尺；SPAD值的測量使用葉綠素儀SPAD-502 Plus（Konnica Monlta，日本）。
鮮重的測量使用精度為0.01 g的電子天平稱量植株的地上部和根系；干重的測量使用烘箱70℃對測完鮮重的植物樣品烘干2 d，再使用精度為0.000 1 g的電子天平稱量。
根直徑、根總長、根總面積和根總體積的測量使用根系掃描儀Epson Twain Pro（Epson，日本）對平鋪的植物根系進行掃描，然后使用根系形態學和結構分析軟件WINRhizo分析計算；地上部投影面積的測量同樣使用根系掃描儀Epson Twain Pro對平鋪的植物地上部（包括葉片和莖）進行掃描，然后使用軟件WINRhizo分析計算。
1.7數據統計分析
分別將5種菌株處理的指標與對照的指標進行t檢驗分析，統計結果P<0.05標記*，P<0.01標記**。統計分析使用軟件SPSS 16.0進行。
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