雌馬酚（equol）是1932年Marrian等在懷孕雌馬的尿液中分離羥雌酮時發現的，并確定分子式為C15H14O3。1982年Axelson等在普通人的尿液中發現了雌馬酚，還證明人在攝入大豆異黃酮后能在腸道菌的參與下降解產生雌馬酚。雌馬酚經尿和膽汁排泄，排出濃度存在個體差異，受大豆異黃酮種類、腸道菌群多樣性、膳食成分等因素的影響，其中主要取決于腸道微生物菌群的組成及代謝能力。Kenneth等通過對41名青年人包括29名素食者和12名非素食主義者進行了研究，用質譜方法（mass spectrometer，MS）分析血清和尿液中大豆苷元和雌馬酚濃度，發現在素食者中雌馬酚產生者為59%，比非素食者高出25%。
近些來，對以人糞樣為樣本分離大豆異黃酮降解菌的研究發展較快，通過對培養條件的優化和控制，獲得多種不同代謝特性的厭氧型降解菌，且多為革蘭氏陽性桿菌。2007年Uchiyama等成功分離出乳酸球菌20-92、真桿菌7-430和梭菌20-197，能將大豆素（daidzein）直接轉化為雌馬酚；Jin等在2008年分離得到菌株PUE和DZE，PUE能將葛根素轉化為大豆素，DZE能將大豆素和染料木素（genistein）分別轉化為Equo和15-OH-equol。Tamura等于2006年分離得到的TM-40菌株，不能直接將大豆素轉化為雌馬酚，只具有將大豆苷（daidzin）和大豆素轉化為雙氫大豆素（dihydrodaidzein，DHD）的能力。在前期的研究中，采集了6位女性素食志愿者的糞樣作為樣本，從中培養分離出LJ-G1和LJ-Q2兩株腸道菌，均為厭氧菌，LJ-G1為革蘭氏陰性桿菌，LJ-Q2為革蘭氏陽性球菌，純培養均具有代謝大豆異黃酮產雌馬酚的能力。
目前雌馬酚的體外獲得主要通過兩種途徑，一是將大豆苷元從大豆中提取出后，在催化劑的作用下還原合成雌馬酚，另一種是篩選出雌馬酚產生菌，進行體外培養，以大豆苷元為底物，從培養液中得到雌馬酚。前者成本較高，不利于雌馬酚的廣泛應用，因此利用微生物發酵法生產雌馬酚具有廣闊的前景。本研究在前期工作基礎上，研究素食者產雌馬酚腸道菌生長規律、優化菌株生長條件，為后續菌株降解大豆異黃酮的代謝研究，開發以生物發酵法制備雌馬酚提供科學參考。
1材料與方法
1.1菌種與試劑
菌種：LJ-G1和LJ-Q2由黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室自素食者糞便分離保藏。
大豆異黃酮（純度80%）西安市天園生物制藥廠；雌馬酚標準品（純度98%）合肥蘭旭生物有限公司；BHI肉湯培養基青島海博生物技術有限公司；瓊脂粉上海山醫學化驗所試劑廠；乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、葡萄糖天津市化學試劑一廠；硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈣、碳酸鈉、硝酸鉀吉林宏久試劑廠。
1.2儀器與設備
YQX-Ⅱ型培養箱上海新苗醫療機械有限公司；超潔凈工作臺上海凈化設備有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；循環水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；電熱恒溫鼓風干燥箱上海恒科學儀器有限公司；TU-1900型雙光束紫外分光光度計北京普析通用儀器有限公司。
1.3方法
1.3.1添加大豆異黃酮培養基制備及菌種活化
本實驗所用器皿均在干燥箱內經150℃、3 h干熱滅菌，液態試劑均在壓力蒸汽滅菌器內經102.9 kPa，20 min濕熱滅菌，無菌操作在超凈工作臺下完成。
稱取9.5 g BHI肉湯培養基溶于250 mL蒸餾水中，調節pH 7.4，加入質量濃度為5 mg/mL的大豆異黃酮溶液，使其終質量濃度為0.75 mg/mL。取保存于斜面的LJ-G1和LJ-Q2菌株，將供試菌種分別接種于BHI肉湯培養基中，置于37℃厭氧培養12 h。取活化好的菌種斜面，用無菌生理鹽水配制菌懸液，采用平板計數法調制菌懸液濃度為106～107CFU/mL，備用。
1.3.2腸道菌生長曲線的測定
生長曲線的測定采用活菌計數法。將活化后的菌液接種于裝有BHI液體培養基的試管中（n=3），接菌量體積分數5%，在48 h內每隔3 h跟蹤測定活菌數，并根據這些實驗數據繪制生長曲線，進行分析，以便更好的掌握和利用其生長規律。按公式（1）計算菌數。
式中：S為培養基中總活菌數/（CFU/mL）；X1、X2、X3為同一稀釋度菌落數/（CFU/mL）；N為菌落稀釋倍數。
1.3.3雌馬酚測定方法
雌馬酚定量測定采用紫外法，將固體培養基用80%乙醇溶液充分溶解后，活性炭脫色6 h、過濾，用聚酰胺樹脂進行純化，5 h后收集純化液，以80%乙醇溶液定容，205 nm波長處測定OD值?；貧w方程為：y=0.174 04x＋0.006 23（R2=0.996 9）。按公式（2）計算培養基中雌馬酚含量。
式中：ρ1為培養基中雌馬酚質量濃度/（μg/mL）；V1為培養基體積/mL；V2為定容后體積/mL；ρ2為回歸方程計算得到的雌馬酚質量濃度/（μg/mL）。
1.3.4不同種類的金屬鹽及其濃度對腸道菌生長的影響
向BHI液體培養基中分別添加MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3溶液，使其濃度（以培養基體積計）分別達到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L，再將活化后的LJ-G1和LJ-Q2的菌液按體積分數5%接種于BHI液體培養基中，37℃厭氧培養36 h，以只接菌未添加金屬鹽的培養基作為對照，BHI液體培養基最大吸收波長為460 nm，因而在此波長處測定光密度（OD）值（n=3），考察各金屬鹽及不同濃度對腸道菌生長的影響。
1.3.5不同碳源對腸道菌的影響
選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖5種碳源，分別添加于BHI培養基中，質量濃度（以培養基體積計）達到10 g/L，以不添加糖為對照。分別接種稀釋度為10-5的LJ-G1和LJ-Q2菌液各0.2 mL，倒置放入厭氧箱中，37℃培養36 h后，采用活菌計數法計數（n=3）。
1.3.6生長條件單因素試驗
單因素試驗主要考慮葡萄糖質量濃度、pH值、NaCl質量濃度這3個因素，在BHI固體培養基上，基礎培養條件為葡萄糖質量濃度（以培養基體積計）7 g/L、pH 7、NaCl質量濃度（以培養基計）4 g/L。接種、培養條件、評價指標按1.3.5節操作，考察各因素適宜范圍。
1.3.7菌株生長條件正交試驗
根據單因素試驗結果，采用L9（34）進行正交試驗，以雌馬酚產量為評價指標，優化生長條件。試驗中的各組平行試驗結果的差異顯著性檢驗均采用常用的統計方法F檢驗法。