摘要：采集受草銨膦污染的香蕉園土壤，通過富集培養技術獲得以草銨膦為唯一碳源生長的微生物C6菌株。結果表明，C6菌株對草銨膦降解率高達69.01%；通過觀察C6菌株的形態學特征結合16S rRNA序列分析，初步鑒定C6菌株為戴爾福特菌屬（Delftiasp.）；進一步探討培養基體積、氮源、草銨膦初始濃度、培養基初始pH值、培養溫度、菌懸液接種量、Na+濃度和Mg2+濃度等因素對C6菌株生長的影響。結果顯示，C6菌株最適宜的培養條件是培養基體積為75 mL、氮源為硫酸銨、草銨膦初始濃度200 mg·L-1、初始pH值8.5、培養溫度25℃、接種量15%、Na+濃度20 g·L-1、Mg2+濃度100 mg·L-1。本研究結果為利用微生物對草銨膦污染土壤進行原位生物修復提供理論依據。
草銨膦（Glufosinate ammonium）又稱草丁膦，化學名為4-［羥基（甲基）膦酰基］-DL-高丙氨酸，化學式為C5H15N2O4P，是一種廣譜型除草劑，具低毒、活性高和環境相容性好等特點。草銨膦通過與植物體中的ATP相結合并占據谷氨酰胺合成酶（glutamine aynthetase，GS）的反應位點，在植物氮代謝過程中阻礙谷氨酸與銨離子合成谷氨酰胺的途徑并隨之破壞其后的代謝過程。主要劑型為溶液劑（水劑），由于其殺草譜廣、發揮活性作用速度較快，廣泛應用于果園、馬鈴薯以及非耕地等田間雜草的治理。
目前因一系列高毒性除草劑（百草枯、草甘膦等）的禁用，以及農用除草劑的市場高需求，草銨膦作為低毒、高活性的廣譜除草劑，其生產量和使用量均居世界前列。隨著使用量的增加，且具有較強的水溶性，容易污染水源并進一步在食物鏈中富集，對環境和人體健康產生潛在威脅，有效降低這些威脅成為目前迫切需要解決的問題。微生物降解是農藥殘留被降解轉換的主要途徑之一，具有適用范圍廣泛、代謝方式多樣且相較于物理、化學降解更安全、綠色和有效，因此研究和應用的前景十分廣闊。現階段國內外關于草銨膦的研究主要集中在作用機理以及在不同環境中的行為、毒性等方面，而對草銨膦的降解菌株及相關降解菌株的生長特性方面的研究尚少。本研究旨在從受草銨膦污染的香蕉果園土壤中分離、篩選可降解草銨膦的微生物菌株，并對草銨膦降解菌株的生長特性進行研究，以期為草銨膦微生物降解的深入研究和草銨膦降解菌的產業化利用提供理論依據。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1供試土壤
福建省漳州市長泰縣常年施用草銨膦的香蕉園，拔除土壤表層雜草和其它雜物后取0～15 cm土樣，迅速取回，置于4℃冰箱保存。
1.1.2培養基
以草銨膦為唯一碳源的基礎鹽培養基，每1 L蒸餾水中組分構成為MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1.31 g、FeSO4·7H2O 0.018 g、NaNO3 3.0 g。外加草銨膦用于培養和分離草銨膦降解菌株。LB培養基為10.0 g蛋白胨、5.0 g酵母粉、NaCl 5.0 g。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基為牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L，pH值7.0～7.2。
1.1.3草銨膦
草銨膦標準品（阿拉丁/G114499-100 mg），購自阿拉丁官網。
1.1.4主要儀器
電子天平（奧豪斯/AR224CN）、超凈工作臺（蘇州安泰/SW-CJ-2FD）、臺式高速離心機（上海安亭/TGL-16C）、立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安/LDZM-80L）、基礎型超純水系統（上海澤拉布/Dura 12FV）、振蕩培養箱（上海知楚/ZQZY-75CN）、生化培養箱（寧波賽福/SPX-250）、pH計（上海儀電/PHS-3C）、超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜儀（安捷倫/1290-6545）、光學顯微鏡（Ci-L，日本）。
1.2草銨膦降解菌株的富集和分離純化
降解菌株的分離純化在參考吳紅萍等方法的基礎上進行適當改良。取10 g土壤加入含有100 mL基礎鹽培養基的250 mL錐形瓶中，外加草銨膦50 mg·mL-1，在生化培養箱中以30℃恒溫、150 r·min-1的培養條件培養3 d。取10 mL上層懸浮液加入到100 mL基礎鹽培養基中，相同條件繼續培養，重復上述培養操作至草銨膦濃度為300 mg·mL-1，在相同的培養條件下培養3個周期。待培養周期結束后，梯度稀釋樣液，并吸取100μg稀釋液涂布于改良高氏一號培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基和牛肉膏蛋白胨固體培養基平板上，分別在30℃和37℃生化培養箱中恒溫培養1～7 d。待菌落長出后，進行觀察，用接種環在分離較好且菌落形態不同的單一菌落上沾取少量菌體放入液體培養基進行培養，培養結束后進行平板劃線，恒溫培養結束后放入冰箱保存備用。
1.3高效降解菌株的篩選
菌株接種到液體培養基中制備懸浮菌液，于振蕩培養箱中培養3 d后，以10%接菌量接種到100 mL含300 mg·L-1草銨膦基礎鹽培養基中，再于振蕩培養箱中培養1個周期。培養結束后，吸取2 mL于2.5 mL具塞離心管中，置于臺式高速離心機中，以10 000 r·min-1離心10 min，通過0.22μm超濾膜過濾上清液1～1.5 mL到樣品管中，用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜儀測定，另設置未添加微生物降解菌株的草銨膦標準品溶液作為對照組，計算菌株的降解率（％）=（C0-Ct）／C0×100％，式中C0為草銨膦初始濃度，Ct為不同菌株降解作用下草銨膦的濃度。
1.4草銨膦降解菌株的形態與分子鑒定
采用平板涂布法將篩選后的草銨膦降解菌株，在生化培養箱中30℃培養12～48 h。參照《常見細菌鑒定手冊》等對降解菌株的形態學特征進行觀察。
進一步采用通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACCCTT-3）擴增菌株序列，并送至北京擎科新業生物技術有限公司進行測序。將所得基因序列在NBCI數據庫進行BLAST同源性比對分析，選取同源性較高的菌株序列，采用MEGA7.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining method）構建菌株系統發育樹。
1.5草銨膦降解菌株的生長因素優化
草銨膦降解菌株生長因子優化采用Liu等方法。將降解菌株接種在50 mL的LB液體培養基（pH值7.0）中，在30℃、150 r·min-1的振蕩培養箱中振蕩培養18～24 h（OD600=0.30），再按5%（V/V）的量接種于基礎鹽培養基中，初始pH值為7.0，初始草銨膦濃度為50 mg·L-1、溫度為30℃、150 r·min-1振蕩培養箱恒溫培養，分別進行以下幾組處理測定生長量的變化，每種因素設3個重復試驗，以接種滅活的菌株為對照組，24 h后取樣測定菌株生長量變化。
設培養基體積分別為25、50、75、100、150、200 mL；設氮源分別為硝酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉；設草銨膦初始濃度分別為10、50、100、200、300、400、500 mg·L-1；用NaOH或HCl調節初始pH值分別至4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0；設培養溫度分別為20、25、30、35、40、45℃；設接種量分別為5%、10%、15%、20%、25%；將菌懸液按5%接種量接入含有草銨膦降解培養基的錐形瓶中，調節初始pH值7.0、7.5，在30℃、150 r·min-1條件下分別加入5、10、20、30、50、100 g·L-1氯化鈉培養1 d后測定草銨膦降解率，重復3次，確定最適Na+濃度。同樣設置Mg2+濃度分別為50、100、200、300、400 mg·L-1。
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