2結果與分析
2.1 PMEC的形態學觀察
經組合酶消化組織塊法分離PMEC,第1代細胞大小不等,種類較為雜亂,但能觀察到有部分細胞貼壁(圖1A);在培養第3代時PMEC與成纖維細胞混雜生長形態多為梭狀與多角形(圖1B);當傳至第8代時,大部分成纖維細胞已被去除,保留了較純的PMEC,其形態多為鵝卵石狀,表現為單層、上皮樣形態,形成單層聚集形島嶼(圖1C);重新復蘇后的PMEC生長狀態良好(圖1D)。
A.第1代細胞,紅框所示為貼壁細胞;B.第3代細胞;C.第8代細胞;D.復蘇后第8代細胞。
圖1 PMEC的形態學觀察
2.2 PMEC生長曲線的測繪
如圖2所示,PMEC生長曲線呈“S”型,培養1~3 d時處于潛伏期,細胞生長較為緩慢;培養3~5 d時為對數生長期,細胞增殖速度明顯提高;培養7~8 d后進入平臺期,細胞增殖速度大幅度降低。上述結果表明,本試驗條件下分離培養的PMEC生長狀態良好。
2.3 PMEC中ZO-1蛋白的表達
IFA結果可見,ZO-1抗體可與蛋白特異性結合,細胞與細胞之間出現了紅色熒光信號,表明PMEC之間形成良好的緊密連接(圖3)。
圖2 PMEC生長曲線
圖3 PMEC中ZO-1的表達
2.4 PMEC中CK-18蛋白的表達
IFA結果可見,CK-18抗體可與該細胞特異性結合,細胞胞漿出現了綠色熒光信號,表明該細胞表達CK-18(圖4)。
圖4 PMEC中CK-18的表達
2.5 PMEC中CNS2基因的轉錄
對PMEC標志基因CNS2進行RT-PCR檢測,結果可見該細胞轉錄CNS2基因,且PMEC經0.2 mg/L與2 mg/L的催乳素刺激后,CNS2基因的轉錄相比對照組均有升高的趨勢。(圖5)。
2.6 PMEC中CNS2蛋白的表達
Western blot檢測結果如圖6所示,未經催乳素刺激的PMEC表達的CNS2較少,而催乳素刺激后PMEC表達的CNS2增多,且隨著催乳素濃度的增大CNS2表達增加(圖6A)。將催乳素刺激組與陰性對照組蛋白的內參歸一化后灰度值統計結果顯示,催乳素刺激組與陰性對照組相比,CNS2蛋白表達極顯著增加,且隨著催乳素濃度的增加,該蛋白的表達也存在顯著的增加(圖6B)。
M.DL 100 DNA Marker;1.未經催乳素刺激的PMEC;2.0.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;3.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;4.從母豬乳汁中提取的總RNA(陽性對照);5.陰性水對照。
圖5催乳素刺激后CNS2基因的轉錄
1.未經催乳素刺激的PMEC;2.經0.2 mg/L催乳素刺激的PMEC;3.經2 mg/L催乳素刺激的PMEC;4.母豬乳汁中提取的蛋白。?表示P<0.05,???表示P<0.001,????表示P<0.000 1。
圖6催乳素刺激后CNS2蛋白的表達
3討論
近幾年來,國內外學者已成功培養出了多種動物的MEC,如人、小鼠、奶牛、水牛、綿羊、山羊等,但是國內對于PMEC分離與培養的研究還比較少。本研究采用組合酶消化組織塊的方法對PMEC進行了分離培養,并通過形態學觀察、生長曲線測定、IFA、PCR等多種手段對其進行鑒定,結果表明本研究成功分離了PMEC,且細胞間形成緊密連接,可用于體外共培養模型的建立。
本研究分離和培養PMEC所用的組合酶消化組織塊法是基于從嚙齒動物身上獲得MEC的方案以及Dahanayaka等分離母豬MEC的方法所制定。組合酶消化組織塊法是使用透明質酸酶和膠原蛋白酶聯合消化豬乳腺組織后獲得PMEC的方法。此方法用時短,采取的組織腺泡發育越好獲得的上皮細胞數目越多,雖會摻雜少量成纖維細胞,但因成纖維細胞與PMEC對胰酶的敏感性不同,可在每次傳代時使用胰酶消化的時間不同進行純化,進而得到純度較高的PMEC。由于慶大霉素可誘導成纖維細胞凋亡(程序性細胞死亡),但MEC對慶大霉素具有高度耐藥性。本研究方法在組織消化液和初始培養液中使用慶大霉素(50μg/mL)來培養從新鮮豬乳腺組織分離的PMEC,以利于去除分離細胞中的成纖維細胞。
MEC的鑒定主要以檢測CK-7、CK-8和CK-18為主,其中檢測CK-18較為普遍。CK-18是一種上皮細胞特有的中間細絲蛋白,是細胞骨架的組成成分,該蛋白是上皮細胞譜系的特異性標記物,其廣泛地應用于多種動物MEC的鑒定。本研究采用IFA對細胞中CK-18進行鑒定,發現分離的細胞高表達CK-18。ZO-1作為特征性緊密連接分子的完整膜蛋白,在細胞間形成單層屏障的過程中起到尤為重要的作用。本研究采用IFA對分離的PMEC進行ZO-1檢測,結果發現細胞間高表達ZO-1,表明PMEC間可以形成緊密連接,為體外共培養模型的建立奠定基礎。CNS2是PMEC的特異性標志物,CNS2的表達與哺乳期乳腺產生催乳素有關。本研究發現不同濃度催乳素刺激下,可以檢測到CNS2的表達,且其表達量與催乳素呈劑量依賴性。
本研究成功分離并培養出原代PMEC,可以用于實驗室研究,為未來研究豬乳腺疾病以及人乳腺類疾病提供了可靠的模型。
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