3討論
3.1RdrA對F44菌株耐酸性能的影響
對F44、△rdrA和FrdrA菌株的酸耐受等表型試驗得出，△rdrA菌株耐酸性能極顯著提升，說明轉錄因子RdrA影響酸應激相關基因的表達，調節細胞代謝活動，抑制F44菌株的酸耐受能力。課題組前期研究發現，乳酸乳球菌F44中轉錄因子YthA參與ADI途徑，促進精氨酸生物合成和極性氨基酸轉運，以此提升菌株酸耐受能力。乳酸乳球菌NZ9000中轉錄因子LssR通過上調ADI通路和表面多糖生物合成通路中的部分基因表達，幫助菌株響應酸脅迫。研究轉錄因子對耐酸性能的影響有助于進一步解析乳酸菌的耐酸機制。
3.2RdrA對F44菌株酸脅迫響應的研究
3.2.1RdrA對細胞壁合成與修飾的影響
如表4所示，相較于F44原始菌株，△rdrA菌株中plpA、plpB、plpC基因轉錄量分別上調1.04、1.23、1.24倍。根據KEGG代謝通路注釋，它們均屬于MetQ家族，編碼ABC轉運蛋白(MetNIQ)中的底物結合蛋白(Substrate-bindingprotein,SBP)。這些蛋白位于細胞膜或跨膜結構域上，通過特異性識別D-蛋氨酸及其衍生物，使跨膜域構象改變，從而完成底物向胞質運輸的過程。
研究表明，細菌可以通過利用D-蛋氨酸修飾細胞壁肽聚糖，以此促進菌株酸耐受能力。在大腸桿菌、棒狀桿菌、植物乳桿菌等多種細菌中，D-蛋氨酸能夠替代細胞壁肽聚糖部分位點的原有氨基酸，修飾細菌細胞壁肽聚糖結構。在乳酸乳球菌F44中，D-蛋氨酸可以替換至肽聚糖胞壁肽的第5位，并且通過這種細菌細胞壁修飾作用提高菌株在酸脅迫環境下的存活率和Nisin產量。
在△rdrA菌株中，細胞可能通過調節D-蛋氨酸轉運的過程，以適應或補償由于RdrA缺失造成的生理變化。轉錄因子RdrA通過下調D-蛋氨酸向胞質轉運水平，抑制細胞壁的合成與修飾過程，進而降低乳酸乳球菌F44的酸耐受和Nisin耐受能力。
3.2.2RdrA對氨基酸合成與代謝的影響
如表4所示，△rdrA菌株中cysD基因轉錄量上調1.01倍。根據KEGG代謝通路注釋，cysD編碼O-乙酰高絲氨酸巰基酶(O-acetylhomoserinesulfhydrylase)。在谷氨酸棒狀桿菌中，氧-乙酰-高絲氨酸(O-Acetyl-L-homoserine)和甲硫醇(Methanethiol)經MetY(CysD同源蛋白)催化生成蛋氨酸和醋酸鹽。這一途徑相較于由天冬氨酸合成蛋氨酸的途徑，需要的NADPH水平較低，而且不需要最終的甲基化過程，減少了碳流失。
有研究指出，在酸性環境下，提高植物乳桿菌胞內的蛋氨酸水平，不僅可以降低同型半胱氨酸積累產生的毒性作用，還可以提高細胞膜中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例，維持細胞膜結構完整性，從而增強植物乳桿菌細胞的酸耐受能力。
這些發現表明，轉錄因子RdrA通過降低O-乙酰高絲氨酸巰基酶的合成水平來抑制蛋氨酸合成途徑，致使細胞毒性累積及細胞膜的飽和脂肪酸比例失調，進而降低乳酸乳球菌F44酸耐受能力。
3.2.3RdrA對DNA修復的影響
如表4所示，△rdrA菌株中DYH_g1322基因轉錄量上調1.67倍。DYH_g1322被eggNOG數據庫注釋為DNA重組修復蛋白RecT編碼基因。RecT參與同源重組過程，對修復DNA損傷，維持基因組穩定起到關鍵作用。在大腸桿菌中，RecET構成一種同源重組途徑，外切酶VIII(recE編碼)以5'-3'的方向降解線性雙鏈DNA，暴露單鏈DNA后由RecT蛋白介導完成同源重組，促進修復斷裂的雙鏈DNA。Zhu等發現，在乳酸乳球菌NZ9000中過表達來自大腸桿菌MG1655和乳酸乳球菌A76的recT基因可以提高NZ9000菌株在乳酸、鹽和乙醇脅迫下的耐受能力以及細胞內三磷酸腺苷濃度，表明酸應激條件下RecT蛋白表達量提升能夠提高菌株酸耐受能力。
因此，轉錄因子RdrA通過下調重組修復蛋白表達，抑制DNA修復途徑，進而降低乳酸乳球菌F44酸耐受能力。
3.2.4RdrA對蛋白修飾的影響
如表4所示，△rdrA菌株中yhjG基因轉錄量上調1.01倍。根據eggNOG數據庫注釋，yhjG編碼蛋白N-乙?；D移酶(ProteinN-acetyltransferase)。有研究指出，在結核分枝桿菌mc(2)155中，rimI基因(與yhjG基因具有同源性)的過表達可以顯著提升菌株的酸耐受性以及對其他多種環境脅迫的耐受能力。
△rdrA菌株酸耐受性增強可能與yhjG基因表達量的上調有關。N-乙?；且环N重要的蛋白質翻譯后修飾方式，這種修飾可能通過改變蛋白質的結構和功能，或通過影響蛋白質的穩定性和降解速率，來幫助細菌適應酸性環境。這一發現為理解細菌如何通過翻譯后修飾來適應環境壓力提供了新的視角。
3.2.5RdrA對F44菌株耐酸性能的影響
通過分析顯著差異表達基因功能，總結了RdrA影響耐酸性能示意圖，如圖7所示。RdrA主要通過抑制D-蛋氨酸轉運結合蛋白(PlpA、PlpB、PlpC)的表達，降低細胞被膜的穩定性，從而使F44菌株對酸脅迫和Nisin脅迫的耐受能力下降。同時，轉錄因子RdrA還通過降低O-乙酰高絲氨酸巰基酶(CysD)、DNA重組修復蛋白(DYH_g1322)和蛋白N端乙酰基轉移酶(YhjG)的表達水平，抑制蛋氨酸合成、DNA修復和蛋白質翻譯后修飾這些細胞關鍵生理過程的活性。這些發現為理解RdrA在細菌耐酸調控中的作用提供了新的見解，并為未來提高工業生產菌株的耐酸性提供了潛在的分子靶點。
圖7轉錄因子RdrA影響耐酸性能示意圖
4結論
研究揭示了乳酸乳球菌F44中與耐酸性能相關的DeoR/GlpR家族轉錄因子RdrA的作用。rdrA突變并不影響菌株生長情況，然而在pH3.0的酸性環境下，rdrA缺陷型菌株的細胞存活率極顯著提高，并且增強Nisin耐受性能。轉錄組分析和qPCR驗證結果表明，轉錄因子RdrA抑制了D-蛋氨酸轉運結合蛋白表達，降低了O-乙酰高絲氨酸巰基酶表達水平，抑制了DNA分子修復和蛋白修飾過程，使乳酸乳球菌F44耐酸能力下調。此外，RdrA削弱細胞被膜的流動性和韌性，降低了F44菌株對Nisin脅迫的耐受能力。對RdrA潛在的調控靶標進行預測和分析，有助于完善乳酸乳球菌的酸耐受機制，為理解乳酸菌如何在酸性環境中維持穩定性和功能性提供新的視角，助力進一步改造發酵工業菌株。
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