1.2.1.2rdrA敲除菌株構建
分別使用rdrA-SY-F/R、rdrA-XY-F/R引物擴增F44基因組rdrA基因上下游各1000bp左右同源臂,以pCS1966質粒為載體,使用BamHI和HindIII酶切位點連接至載體上。用同源重組雙交換原理敲除靶標基因，通過含有5-氟乳清酸的合成培養基篩選得到rdrA缺失型菌株，使用rdrA-NB-F/R、rdrA-XJ-F/R引物進行菌落PCR并進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。設計引物如表2所示。
表2rdrA敲除菌株構建引物序列
1.2.2表型檢測
1.2.2.1生長曲線和pH曲線
F44、DeltardrA和FrdrA菌株連續活化3代后,按體積分數1%的接種量接種于100mL液體種子培養基中，30℃靜置培養,每2h混勻菌液并取樣,測定600nm波長處的吸光度OD_{600~{}nm}和pH值,繪制生長曲線和pH曲線。
1.2.2.2Nisin耐受
稱取1000IU/mg的NisinZ標準品溶于化開的固體種子培養基,制備得到含10000IU/mL的Nisin固體種子培養基。將活化3代后的F44和DeltardrA菌株培養8h,調整OD_{600~{}nm}至一致,等濃度梯度稀釋后將10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋菌液各吸取10μL依次在平板上點樣，30℃下培養2~3d，觀察菌落生長情況。
1.2.2.3酸耐受
檢測F44、DeltardrA和FrdrA菌株在pH3.0環境下應激1h后的存活率。活化3代后的3種菌株培養至7h時分別取5mL,以8000r/min離心5min,棄凈上清液，加入5mLpH3.0的種子培養基吹吸混勻繼續培養1h。將酸應激前后的菌液分別等濃度梯度稀釋至合適濃度，在固體種子培養基上涂布計數。以酸應激后活菌數與酸應激前的活菌數之比記作菌株存活率，反映菌株酸耐受能力。
1.2.2.4Nisin效價
用改良LB培養基充分活化藤黃微球菌，稀釋至合適濃度后加入化開的固體效價培養基，待凝固后打孔作為效價檢測培養基。稱取1000IU/mg的NisinZ標準品分別配制50、100、200、400IU/mL的Nisin標準液加入效價檢測培養基孔內，以抑菌圈直徑為橫坐標，以10為底的標準品濃度的對數值為縱坐標繪制標準曲線。將活化3代后的F44和DeltardrA菌株按體積分數5%的接種量接種于100mL液體發酵培養基中，在培養至6、8、10、12h時各取500μL菌液加入500μL0.02mol/LHCl溶液，混勻后金屬浴100℃煮沸5min,12000r/min離心3min,取上清加入培養基孔內，測量抑菌圈直徑，代入標準曲線計算Nisin效價。
1.2.3轉錄組學測序
將活化3代的F44和DeltardrA菌株培養5h至對數中期,4℃下以8000r/min離心3min,收集菌體制備轉錄組學測序樣品。提取細菌總RNA,隨機打斷后經兩次合成獲得cDNA第2鏈，經修復、連接、擴增、純化后獲得文庫。文庫質控合格后進行轉錄組學測序，對原始數據過濾后，用每百萬片段中來自某一基因每千堿基長度的片段數目(Fragmentsperkilobasespermillionfragments,FPKM)表示基因原始表達量。采用DEseq軟件對基因表達進行差異分析，以log2foldchange表示試驗組與對照組基因表達量差異倍數，以P<0.05且log2foldchange(DeltardrA/F44)
1為篩選條件，獲得顯著差異表達基因并進行后續分析。
1.2.4實時熒光定量PCR驗證
對培養至與轉錄組學送測樣品相同條件的F44和DeltardrA菌株用細菌總RNA提取試劑盒DP430提取總RNA。使用2xSYBRGreenqPCRMix試劑盒反轉錄生成cDNA。然后在LightCycler480II實時熒光定量PCR儀上進行qPCR試驗,以16SrRNA基因作內參,進行3次生物學重復,用2-DeltaDeltaCt方法計算相對表達量。設計引物如表3所示。
表3實時熒光定量PCR引物序列
1.2.5數據處理
使用Excel2021匯總分析試驗數據;使用OriginPro2021繪制圖表。使用t檢驗計算差異顯著性,其中P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。
2結果與分析
2.1突變菌株構建
利用電轉化方法將測序無誤的重組質粒轉入乳酸乳球菌,使用pLEB124-YZ-F/R引物進行菌落PCR并進行瓊脂糖凝膠電泳驗證，成功得到F44-rdrA過表達菌株,記作FrdrA。陽性結果條帶為977bp,對應圖1A中泳道1~泳道8。
利用同源重組方法構建乳酸乳球菌F44-rdrA敲除菌株，經過單交換和雙交換兩輪篩選后，使用rdrA-NB-F/rdrA-NB-R、rdrA-XJ-F/rdrA-XJ-R引物進行菌落PCR并進行瓊脂糖凝膠電泳，成功得到F44-rdrA敲除菌株，記作DeltardrA，陽性結果對應圖1B中的泳道5、泳道6、泳道7、泳道24，其中圖1B為rdrA-NB-F/rdrA-NB-R引物PCR結果，陽性結果為無條帶;圖1C為rdrA-XJ-F/rdrA-XJ-R引物PCR結果，陽性結果條帶為403bp。
2.2表型結果分析
通過測定生長曲線和pH曲線發現，F44、DeltardrA和FrdrA菌株生長情況無顯著區別，菌株生長遲緩期、對數期、平臺期的時間、菌體量和菌液pH值基本保持一致(圖2A、圖2B)。
對F44和DeltardrA進行Nisin耐受性試驗,結果如圖2C所示,DeltardrA菌株的最大有效稀釋量為1:10^6,F44對照菌株的最大有效稀釋量僅為1:10^4，敲除rdrA基因使F44菌株Nisin耐受能力增強。